Трансплантация на амниотична мембрана - логистика, хирургически техники и микроструктурен анализ на резултатите
Резюмe
Цел
Целта на настоящия дисертационен труд е да се оцени клиничния ефект от трансплантацията на амниотична мембрана (АМ) при пациенти с нарушена очна повърхност. Въз основа на получените резултати да се създадат стандарти за приложение на АМ при различни патологични промени, засягащи очната повърхност за България, съобразени с Европейските и световни директиви.
Материали и методи
Настоящото проучване е проведено в Катедрата по очни болести и зрителни науки на Медицински университет - Варна на територията на Специализирана болница по Очни болести за активно лечение - гр.Варна за период от 7 години. В него са включени 306 пациента преминали, изследвани и оперирани в СБОБАЛ в рамките на 7 годишен период (oт 01.2010г. до 10.2016г.). Общия брой на извършени трансплантации на амниотична мембрана (АМТ) е 546. На всички пациенти е извършена трансплантация на криосъхранена АМ. В периода от 2010 до 2013 е използвана свободна АМ на тъканна банка Пирогов, от 2014 до 2016 - АМ фиксирана върху нитроцелулозна хартия на тъканна банка Биорегенерация и от 09.2016г. - АМ фиксирана върху нитроцелулозна хартия на Центъра за транслационна медицина и клетъчна терaпия към МУ-Варна. В зависимост от тежестта на обективната симптоматика и вида на заболяването е извършена трансплантация тип покритие и/или пълнител в един, два или повече слоя. Направена е оценка на субективната симптоматика и обективните признаци, степенувани по тежест, както и оценка на връзката между вида на трансплантацията и съответните симптоми и признаци. С помощта на IVCM е направена качествена и количествена оценка на промените в амниотичната мембрана и таргетната тъкан на микроструктурно ниво. АS-OCT е използвана за морфометричен анализ и оценка на промените в дебелината на дефектните участъци на роговицата и е извършено наблюдение на поведението и интеграцията на амниотичната мембрана в рецепиентната тъкан.
Резултати
Резултатите от настоящото проучване показват важната роля на АМ за лечение на увредената очна повърхност, което често е свързано със забавено възстановяване и риск от вътреочно възпаление. Важна част от дискомфорта е болката, която е основен социален проблем, влияещ на качеството на живот. В предоперативният период е установено, че над 75 % от пациентите изпитват умерена и постоянно тежка болка, докато в постоперативния период болката значително намалява още на 8-мия ден и това усещане персистира и на 25ти ден. Най-добро повлияване на болката е установено при посттравматичните, вирусните кератити, последвано от рецидивиращите дефекти и невротрофичните язви. В групите на травмите и изгарянията и групата други, въпреки лекото покачване на болката тя остава на 50 % спрямо изходната стойност, докато при бактериалните кератити промяната е с 40 % от изходната. В допълнение към болката е демонстрирано, че АМ има положителен ефект и върху други важни субективни фактори като сълзенето, фотофобията и наличието на сълзене и секрет.
Обективното проследяване е базирано на оценка на степента на инекция, измерване на големината и дълбочината на роговичната язва, повлияването на инфилтрати и хипопион. Предоперативно големината на роговичния дефект е по-голяма при три от изследваните групи: невротрофични язви, бактериални кератити, травми и изгаряния. Постоперативно на 25-тия ден е отчетена най-голяма ефективност при 4 от посочените групи (бактериални, постоперативни кератити, роговични рецидивиращи дефекти, травми и изгаряния (>50%, p<0.0001). Предоперативно най-изразена дълбочина на язвата (20-50% от дълбочината на роговицата) има при травми и изгаряния и бактериални кератити, последвани от вирусните и невротрофичните язви. На 25-ти ден: най-изразен ефект е наблюдаван при травмите и изгаряния. При всички други групи ефектът е под 40%. Минимален резултат е отчетен при постоперативните кератити (9%), вероятно поради високия дял на пациентите с булозна кератопатия в групата. Предоперативно е установено изразено наличие на инфилтрати при бактериалните и вирусните кератити и в по-малка степен при невротрофичните язви. От тях сигнификантна разлика на 25-тия постоперативен ден е отчетено при бактериалните кератити (71%). При тези кератити е наблюдавано по-често хипопион, като в групата ефектът след приложение на АМ е >70%. Следват вирусните кератити с по-малка степен на хипопион, но при тях имаме по-слаба степен на повлияване от АМ до 30%. В по-голямата част от групите липсва хипопион и в единичните случаи, когато се диагностицира, той се повлиява на 100%.
IVCM е изключително сложно изследване при пациенти с нарушена очна повърхност. Предоперативно с IVCM ясно се визуализират пет слоя на АМ (епител, базална мембрана, компактен слой, фибробластен слой и спонгиозен слой). На 2-рия ден от трансплантацията средната плътност на АЕC е 3026±50кл/mm2. Средната дебелина на АМ е 118±40µm. Под епителния слой на АМ се наблюдават новообразувани големи, плоски, незрели клетки на повърхностния епител на роговицата със средна плътност 598,4±66,38кл/mm2. Базалните клетки също показват незрялост и средната им плътност е 1804±93,32кл/mm2. На 8ми и 25-тия ден се наблюдава постепенно увеличаване плътността на зрелите повърхностни и базални клетки, наличие на суббазален нервен плексус и нормално разпределение на кератоцитите в повърхностните и дълбоките слоеве. По отношение на амниотичната мембрана на 8-мия ден са визуализирани единични, а на 25тия ден липсват ясно разграничими слоеве.
Mорфометричният анализ с помощта на AS-OCT при пациенти с нарушена очна повърхност представя подобни на литературатра резултати по отношение подобрението в роговичната дебелина още на 8-мия ден, което е сигнификатно значимо спрямо изходната стойност. На 25-тия ден единствено в групата на бактериалните и постоперативни кератити е наблюдавано подобряване на дебелината, докато в останалите групи има известен спад, но той е до 10% спрямо дебелината на 8-мия ден. При дълбоки дефекти успешно е използвана комбинирана техника тип пълнител и покритие, като най-често използвания метод е „pleats folds” техниката. АМТ възстановява перфорирани участъци на роговицата за продължителен период от време. Констатирано е също така, че извършването на трансплантация при активно възпаление не води до успех от последващата палиативна интервенция- кератопластика. Най-често усложнение е стапяне на трансплантата.
Установено е, че предимството на AM в реконструкцията на очната повърхност е, че има по-добър козметичен резултат, има по-добра видимост за мониториране на възстановителните процеси и туморните рецидиви. Тя е по-тънка и по-прозрачна отколкото оралните мукозни мембрани. Фактор, който може да доведе до неуспех от трансплантацията на AM е хроничната сухота и пълното унищожаване на конюнктивалните стволови клетки. В зависимост от големината на дефекта е използвана или самостоятелно АМ, или комбинация от АМ и конюнктивален авто или алотрансплантат.
Човешката АМ е динамична тъкан, която се променя през бременността, така че да се адаптира към нуждите на плода. Освен това съставът на амниона, включително растежните фактори, дебелината и хистологията варират при различните донори. Човешката АМ от 38-39 гестационна седмица и 35годишен донор са с по-високи нива на растежни фактори, което разбира се оказва влияние и на терапевтичния ефект на мембраната. Необходим е внимателен подбор на донорите с оглед постигането на максимално добър терапевтичен ефект, което е посочено като изискване в стандартните оперативни процедури създадени за Центъра за транслационна медицина и клетъчна терапия към УМБАЛ „Св. Марина“.
Заключение
Амниотичната мембрана е доказано средство на избор при труднолечими, рецидивиращи и тежки патологии на предния очен сегмент. Тя е биологичен субстрат, алотрансплантат с огромен потенциал за лечение, като намалява нуждата от продължителното използване на токсични субстанции и намалява директния досег на консервантите до очната повърхност.
Abstract
Аim
The aim of this study is to evaluate the clinical effect by transplantation of amniotic membrane in patients with violation of the AOS. On the basis of the results obtained to establish standards for the application of amniotic membrane in different pathological changes affecting the eye surface for Bulgaria, and in accordance with European and International Directives.
Methods
Тhis study was conducted at the Department of Ophthalmology and Visual Sciences at the Medical University of Varna on the territory of the Eye Hospital - Varna for a period of 7 years. It featured 306 patient who passed аnd were tested and operated in the Eye Hospital within the 7-year period (from 01.2010 to 10.2016). The total number of transplants performed on the amniotic membrane was 546. Cryopreserved amniotic membranes were used in all patients. During the period from 2010 to 2013 was used free AM from the Pirogov Tissue Bank, from 2014 to 2016 - AM fixed on the nitrocellulose paper tissue bank Bioregeneracia and from 09.2016 2010 - AM fixed on the nitrocellulose paper from Center for translational medicine and cellular therapy to the Medical University – Varna. Depending on the severity of the symptoms and the type of the disease the transplant type onlay and/or inlay in one, two or more layers is carried out. The basic principles have been observed for the storage and use of AM after delivery. AS-OCT was used for the morphometric analysis and evaluation of changes in the thickness of the damaged parts of the cornea. We also monitored the behavior and integration of amniotic membrane in the recipient tissue.
Results
The results of this study show the important role of the amniotic membrane for treatment of damaged ocular surface, often associated with delayed recovery and risk of intraocular inflammation. An important part of the discomfort is pain, which is a major social problem affecting the quality of life. In the pre-op period, we established that over 75% of patients experience moderate and constant severe pain while in the postoperative period the pain greatly reduced even on the 8th day and the feeling persists and the 25th day also. The best results in pain relief are established in post traumatic cases and patients with virus keratitis, followed by patients with recurrent defects and neurotrophic ulcers. In the groups of injuries and burns and other groups, despite the slight rise in pain, it stays at 50% of the source value, while in bacterial keratitis change is with 40% of the source value. In addition to the pain it was demonstrated that AM has a positive effect on other important factors such as subjective symptoms, like photophobia and the presence of tearing and discharge.
Objective monitoring is based on an assessment of the extent of the degree of injection, measurement of the size and depth of corneal ulcer, influence on infiltrates and hypopion. Pре-operatively the size of the defect is greater in three of the groups: neurotrophic ulcers, bacterial keratitis, injuries and burns. Of the 25th post-op day we recognized the greatest efficiency in 4 of those groups (bacterial, post operative keratiti, corneal recurrent defects, injuries and burns (> 50%, p < 0.0001). Pre-operatively the depth of the ulcer is the mostly expressed (20-50% from the depth of the cornea) in injuries and burns and bacterial keratitis, followed by viral and neurotrophic ulcers.On the 25th day the greatest effect is observed with injuries and burns. In all other groups, the effect is below 40%. A minimal result is reported in postoperative keratitis (9%), probably due to the high percentage of patients with bullous keratopathy in the group. Preoperatively was established the presence of infiltrates, in bacterial and viral keratitis and to a lesser extent in the neurotrophic ulcers. Of them a significantdifference on the 25th postoperative day was reported in bacterial keratitis (71%). In these keratitis we observe more often hypopion, as in the group the еfficacy after application of AM the effect is >70%. The viral keratitis follow up with a lesser degree of hypopion, but they have a weaker degree of response of AM of up to 30%. In the majority of the groups hypopion is missing and in single cases when diagnosed, it responds to 100%.
IVCM is extremely complicated study in patients with impaired eye surface diseases. Pre-op clearly reviewed are the display the five layers (epithelium, basal membrane, compact layer, fibroblastic layer and spongiozic layer). On the 2thday of AMT the average thickness is about 118 ± 40µm and the average number of epithelial amniotic cells is about 3026 ± 50cells/mm2. On the 8thday single layers are displayed and on the 25thday no identifiable layers are found. On the first day after the AMT the average density of the epithelial cells was 4613kl/mm2 (SD 380), the average thickness of the epithelium was 35 µm, and the average thickness of the stroma was 116 µm. On the 15thday loss of AEC was observed. Full re-epitelization occurred between 1st and 4th week.
Morphometric analysis using AS-OCT in patients with impaired ocular surface presents similar to the literature results regarding the improvement in corneal thickness even on the 8th day, which is significant in relation to the baseline source value. On the 25th day improvement of thickness is observed only in the group of bacterial and post operative keratitis, while in other groups there is some decline, but it is up to 10% of the thickness on the 8th day. With deep defects we successfully use a combined technique type filler and coating, as the most commonly used method is the "pleats folds" technique. AMT recovers perforated sections of the cornea for prolonged period of time. We noted also that transplantation in eyes with active inflammation does not lead to success of subsequent palliative intervention - keratoplasty. The most common complication is melting of the transplant.
According to us the advantage of AM in the reconstruction of the ocular surface is that there is a better cosmetic result, better visibility for monitoring the recovery processes and tumor recurrences. It is thinner and more transparent than the oral mucose membranes. A factor that may lead to failure of the transplant of AM is chronic dryness and total destruction of the conjunctival stem cells. Depending on the size of the defect we use either AM alone or combination of AM and conjunctival auto- or alotransplant.
HAM is dynamic tissue that is changing during pregnancy in order to adapt to needs of the fetus. In addition, the composition of amnion, including maturation, thickness and growth factors varies among different donors. Therefore, the HAM of 38-39 weeks of gestation and 35 year old donor has higher levels of growth factors, which of course will affect the therapeutic effect of the membrane. A careful selection of donors is needed in order to achieve the maximum good therapeutic effect, which is requirement in our standard operating procedures.
Conclusion
Amniotic membrane is proven method of choice for difficult to treat, recurrent and severe pathologies of the anterior eye segment. It is a biological substrate, alotransplant with huge potential for treatment, reducing the need for the continued use of toxic substances and decreases the direct contact of preservatives to the eye surface.